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Risonanza Magnetica Nucleare vede le proteine al lavoro

Rappresentazione grafica di una proteina GroEL alla caccia di una proteina Ap. (Credit: Fawzi lab / Brown University)Quando si lavora ad un caso difficile, gli investigatori intelligenti provano qualcosa di nuovo.

Adottando un approccio innovativo alla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) - una miscela di quattro tecniche - degli scienziati sono riusciti a risolvere una interazione fondamentale tra due proteine, ​​che non era mai stata osservata prima.


Essi riferiscono le loro conclusioni sul numero del 24 giugno 2013 di Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).


L'interazione, che il team ha descritto per primo, è quasi universale in tutta la vita. Una macchina proteica chiamata chaperone [=cicerone] si impadronisce di una piccola proteina disordinata per aiutarla a trovare la sua corretta conformazione di piegatura. In questo caso, il team ha impostato degli esperimenti in provetta per vedere il chaperone batterico GroEL, a forma di capsula, catturare una proteina amiloide-β malata (Aβ), una molecola che è centrale nell'Alzheimer degli esseri umani.


Le due proteine sono ben studiate, ma finora la dinamica del loro primo incontro (quando la capsula GroEL aperta cattura l'obiettivo) era rimasta invisibile agli scienziati. La microscopia elettronica e la cristallografia a raggi X sono buone solo per scattare istantanee di momenti facilmente fissabili nel tempo. La NMR è in grado di rilevare le interazioni e la cinetica dei contatti tra le proteine nel momento in cui si verificano, ma, in alcuni casi, ogni singola tecnica può fornire solo indizi e accenni di quello che sta succedendo.


Nicolas Fawzi, biologo della Brown University, ricercatore post-dottorato nel gruppo di Marius Clore all'Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali (NIDDK) all'interno del National Institutes of Health (NIH), ha lavorato con David Libich, Jinfa Yang e Marius Clore, co-autori e ricercatori del NIDDK per mettere insieme la storia delle proteine, combinando quattro diverse tecniche di NMR. Hanno capito quello che ognuna di loro poteva dire sull'interazione e hanno costruito il caso presentato su PNAS.


"Nessuna delle quattro tecniche da sole ci può dare informazioni sufficienti"
, spiega Fawzi, assistente professore di scienza medica nel Dipartimento di Farmacologia Molecolare, Fisiologia e Biotecnologie della Brown. "Solo usandole tutte insieme possiamo capire la struttura e la dinamica dell'Aβ quando si lega al GroEL. Le quattro misure indirette insieme ci hanno dato un quadro completo".


I ricercatori hanno agito come un gruppo di investigatori che lavorano su un caso in cui nessun testimone ha visto tutto. Invece hanno trovato tre testimoni che hanno contribuito ognuno con qualcosa di diverso, e poi un altro che ha avvalorato alcune delle cose che gli altri hanno rivelato ed escluso altre possibilità. Le tecniche NMR usate erano

  1. lifetime line broadening,
  2. spettroscopia a dispersione di rilassamento Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG,
  3. cambiamenti chimici indotti da scambio e
  4. spettroscopia Dark-state Exchange Saturation Transfer (DEST)


"La quarta tecnica l'
abbiamo sviluppata nel mio laboratorio al NIH nel 2011", dice Clore, che è anche autore corrispondente della rivista. "Abbiamo potuto condurre la nostra ricerca in modo più efficace usando tale strumento per confermare ed estendere le informazioni uscite dalle altre tre tecniche".

 

Rimbalzi con il cicerone

Il mistero dibattuto tra i biologi molecolari era: cosa richiede il chaperone GroEL ai prigionieri nel momento in cui li imgaggiano? Li costringe in una particolare conformazione? Li tiene saldamente mentre chiude il coperchio della capsula intorno alla proteina più piccola, o il prigioniero resta completamente dinamico?


Il team ha osservato che il GroEL è un rapitore permissivo. Esso vincola l'Aβ solo in due siti "idrofobi", lasciando tuttavia la proteina più piccola a penzolare in varie conformazioni. Inoltre non la tiene legata per tutto il tempo, lasciandola invece staccarsi e ri-legarsi. Essenzialmente l'Aβ rimbalza dentro e fuori la cavità vincolante del GroEL. "Con queste quattro tecniche insieme siamo riusciti ad estrarre informazioni sulla struttura della proteina, mentre si lega così come sulla velocità con cui entra ed esce e quello che sta facendo in ogni posizione", spiega Fawzi. "Anziché formare una struttura più particolare dopo il legame, sembra mantenere una grande eterogeneità conformazionale".


La tecnica lifetime line broadening, per esempio, ha detto loro che l'Aβ interagisce con qualcosa di grande (GroEL), mentre osservazioni CPMG e cambiamenti chimici, combinati, mostrano il tempo passato dall'Aβ nel GroEL prima di sganciarsi, come pure i dettagli strutturali dell'Aβ quando è legato al GroEL. La DEST fornisce informazioni che potrebbero confermare gran parte della storia delle altre tecniche.


Fawzi dice che l'approccio pacifico del GroEL potrebbe servire a legare molte proteine differenti in conformazioni disordinate, ma anche a risparmiare energia. Forzare le proteine in una conformazione specifica solo per produrre e sostenere la cattura iniziale richiederebbe più energia di quanto vale la pena. Alla fine, in un momento successivo a quello esaminato dal team in questo studio, il GroEL chiude il coperchio e incapsula completamente le proteine bersaglio, ha detto Fawzi. Questo è quando investe nel forzarle a ripiegarsi nel modo giusto.


Per i biologi molecolari e strutturali, la miscela appena provata di tecniche NMR potrebbe aprire una serie di altri casi irrisolti di interazioni elusive. "Ora possiamo vedere come queste grandi macchine possono fare il loro lavoro, mentre lo stanno facendo", conclude Fawzi. "Questo non è limitato solo a questo macchinario GroEL".


La ricerca è stata finanziata dal Programma Intramurale di ricerca del NIDDK e completato dall'Intramural AIDS Targeted Antiviral Program del direttore NIH.

 

 

 

 

 


Fonte: Brown University.

Riferimento: D. S. Libich, N. L. Fawzi, J. Ying, G. M. Clore. Probing the transient dark state of substrate binding to GroEL by relaxation-based solution NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013; DOI: 10.1073/pnas.1305715110

Pubblicato in Science Daily (> English version) - Traduzione di Franco Pellizzari.

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