Ricerche

Un microscopio appena sviluppato sta fornendo agli scienziati uno strumento notevolmente migliorato per studiare come i disturbi neurologici come l'epilessia e l'Alzheimer influenzano la comunicazione neuronale.

Il microscopio è ottimizzato per eseguire studi con tecniche di optogenetica, una tecnologia relativamente nuova che usa la luce per controllare e visualizzare i neuroni geneticamente modificati con proteine ​​sensibili alla luce.

"Il nostro nuovo microscopio può essere usato per esplorare gli effetti di diverse mutazioni genetiche sulla funzione neuronale", ha dichiarato Adam Cohen della Harvard University in USA, e responsabile del gruppo di ricerca che ha sviluppato il microscopio. "Un giorno potrebbe essere usato per testare gli effetti dei farmaci sperimentali sui neuroni derivati ​​da persone con disturbi del sistema nervoso, e cercare di identificare i farmaci per curare le malattie che non hanno trattamenti adeguati in questo momento".

Il nuovo microscopio, chiamato Firefly, può vedere un'area di 6 mm di diametro, oltre cento volte più grande del campo visivo della maggior parte dei microscopi usati per l'optogenetica. Piuttosto che studiare l'attività elettrica di un neurone, l'ampia area di scansione rende possibile individuare gli impulsi elettrici che i neuroni usano per comunicare e poi osservare quegli impulsi che viaggiano da una cellula all'altra attraverso un grande circuito neurale contenente centinaia di cellule.

Nel cervello, ogni neurone si connette di solito ad altri mille neuroni, quindi la visualizzazione di una rete più grande è importante per capire come le malattie neurologiche influenzano la comunicazione neuronale.

Sulla rivista Biomedical Optics Express della The Optical Society, Cohen e i suoi colleghi riferiscono di aver assemblato il nuovo microscopio con meno di $ 100.000 usando componenti che sono quasi tutti disponibili in commercio. Il microscopio non solo vede un'area vasta, ma raccoglie anche la luce in modo estremamente efficiente. Ciò fornisce l'alta qualità dell'immagine e la velocità necessaria per osservare impulsi elettrici neuronali che durano solo un millesimo di secondo.

Usare la luce per vedere i neuroni che 'sparano'

Il nuovo microscopio è ideale per lo studio dei neuroni umani allevati in laboratorio. Nell'ultimo decennio, gli scienziati hanno sviluppato modelli di cellule umane per molti disturbi del sistema nervoso. Queste cellule possono essere geneticamente modificate per contenere proteine ​​sensibili alla luce che consentono agli scienziati di usare la luce per far sparare i neuroni o per controllare variabili come i livelli dei neurotrasmettitori o l'aggregazione delle proteine. Altre proteine ​​fluorescenti sensibili alla luce trasformano gli impulsi elettrici invisibili provenienti dai neuroni in brevi lampi di fluorescenza che possono essere ripresi e misurati.

Queste tecniche hanno permesso agli scienziati di studiare i messaggi in entrata e in uscita dai singoli neuroni, ma i microscopi disponibili in commercio non sono ottimizzati per sfruttare appieno il potenziale degli approcci optogenetici. Per colmare questa lacuna tecnologica, i ricercatori hanno progettato il microscopio Firefly per stimolare i neuroni con un modello complesso contenente un milione di punti luce e quindi registrare i brevi lampi di fluorescenza della luce che corrispondono a impulsi elettrici sparati ​​dai neuroni.

Ogni pixel del modello di luce può stimolare in modo indipendente una proteina sensibile alla luce. Poiché i pixel possono essere di molti colori distinti, è possibile attivare contemporaneamente diversi tipi di proteine ​​sensibili alla luce. Il modello di luce può essere programmato per coprire un intero neurone, stimolare determinate aree di un neurone o essere utilizzato per illuminare più cellule contemporaneamente. "Questo sistema ottico fornisce un milione di segnali in entrata e un milione in uscita, permettendoci di vedere tutto ciò che accade in queste culture neurali", ha spiegato Cohen.

Dopo aver stimolato i neuroni, il microscopio usa una macchina fotografica a migliaia di fotogrammi al secondo per catturare la fluorescenza indotta dagli impulsi elettrici estremamente brevi. "Il sistema ottico deve essere altamente efficiente per rilevare i buoni segnali entro un millisecondo", ha affermato Cohen. "Una buona parte dell'ingegneria è stata dedicata allo sviluppo di ottiche che non solo possono rappresentare una vasta area, ma lo fanno con un'efficienza molto elevata di cattura della luce".

Per cogliere in modo efficiente la luce su una vasta area, il microscopio Firefly usa una lente obiettivo delle dimensioni di una lattina piuttosto che la lente obbiettivo usata dalla maggior parte dei microscopi. I ricercatori hanno anche usato una configurazione ottica che aumenta la quantità di luce che stimola i neuroni per garantire che i neuroni emettano una fluorescenza luminosa durante lo sparo.

"L'unico elemento personalizzato nel microscopio è un piccolo prisma posto tra i neuroni e la lente dell'obiettivo", ha spiegato Cohen. "Questo componente importante fa sì che la luce viaggi lungo lo stesso piano delle cellule piuttosto che entrare nel campione perpendicolarmente, mantenendo la luce del materiale illuminante sopra e sotto le cellule, riducendo la fluorescenza di fondo che renderebbe difficile vedere la fluorescenza che proviene in realtà da i neuroni".

Vedere 85 neuroni contemporaneamente

I ricercatori hanno mostrato il loro nuovo microscopio usandolo per stimolare otticamente e registrare la fluorescenza dai neuroni umani in coltura. "I neuroni erano una grande confusione di spaghetti", ha detto Cohen. "Abbiamo dimostrato che è possibile risolvere 85 singoli neuroni contemporaneamente in una misurazione che richiede circa 30 secondi".

Dopo la stimolazione iniziale e la scansione, i ricercatori sono riusciti a trovare 79 di quelle 85 cellule una seconda volta. Questa capacità è importante per gli studi che richiedono che ogni cellula venga vista prima e dopo l'esposizione a un farmaco, per esempio.

In una seconda dimostrazione, i ricercatori hanno usato il microscopio per mappare le onde elettriche che si propagano attraverso le cellule cardiache coltivate. Questo ha dimostrato che il microscopio poteva essere utilizzato per studiare i ritmi cardiaci anormali, che si verificano quando i segnali elettrici che coordinano i battiti cardiaci non funzionano correttamente.

"Il sistema che abbiamo sviluppato è progettato per guardare un campione relativamente piatto come le cellule in coltura", ha detto Cohen. "Stiamo ora sviluppando un sistema per eseguire approcci optogenetici nel tessuto intatto, che ci consentirebbe di osservare come questi neuroni si comportano nel loro contesto nativo".

I ricercatori hanno anche fondato una società di biotecnologie chiamata Q-State Biosciences che sta usando una versione migliorata del microscopio per lavorare con aziende farmaceutiche alla scoperta di nuovi farmaci.

L'ampio campo visivo del microscopio e la capacità di visualizzazione veloce consentono di vedere i segnali elettrici che viaggiano rapidamente da neurone a neurone. L'osservazione della rete neuronale così grande è importante per capire come le malattie neurologiche influenzano la comunicazione neuronale.